В недавнем исследовании, опубликованном в Cell, исследователи использовали мультиплексированную и трехмерную визуализацию с машинным обучением и пространственной статистикой для выполнения молекулярных и морфологических оценок колоректального рака (CRC).

Исследование: Мультиплексированный 3D атлас переходов состояния и иммунного взаимодействия при колоректальном раке. Изображение: Anatomy Image/Shutterstock

Твердые опухоли на поздней стадии представляют собой сложные ассимиляции опухолевых клеток, стромальных клеток и иммунологических клеток со значительными гистоморфологическими вариациями внутри опухоли. Традиционный гистопатологический анализ обеспечивает недостаточные данные для точной медицины и механистических исследований. Пространственные атласы опухоли могут основываться на гистологической основе и современной генетике опухоли путем получения углубленных трехмерных морфологических и молекулярных данных.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи провели новый высокомультиплексный трехмерный анализ изображений тканей для построения атласов CRC, предоставляющих данные в субклеточном разрешении.

Изображения были сегментированы, а их интенсивность флуоресценции была количественно определена для генерации данных на уровне сингулярных клеток о клеточных типах, состоянии и клеточно-клеточных взаимодействиях. Трехмерные реконструкции последовательного сечения тканей были подготовлены и контролировались машинным обучением. Для анализа опухолевых клеток были использованы два подхода: подход “снизу вверх” и “сверх-вниз”.

Подход «снизу вверх» включал использование пространственной статистики для перечисления типа клеток, оценки клеточных взаимодействий и создания местных окрестностей, использование инструментов, используемых в одноклеточном анализе, таких как масс-цитометрия и секвенирование одноклеточной рибонуклеиновой кислоты (scRNA-seq). Напротив, подход «сверху вниз» включал в себя аннотирование гистологических особенностей или гистотипов, связанных с состояниями или исходами заболевания, с последующими мультиплексными расчетами данных для выявления базовых закономерностей на молекулярном уровне.

Высокоплексный циклический иммунофлуоресцентный анализ (CyCIF) и изображения CRC, окрашенные гематоксилином и эозином (H&E), полученные в результате гистопатологического анализа, были объединены с анализом scRNA-seq и микрорегиональным транскриптомическим анализом. Кроме того, изображения CyCIF были проанализированы с помощью t-SNE (t-распределенная стохастическая встраивание соседей), а транскриптомные микрорегионы были проанализированы с помощью PCA (основной компонентный анализ). Кроме того, был проведен анализ виртуального тканевого микрочипа (vTMA).

Результаты

Мультиплексный анализ показал смешанные морфологии опухоли и молекулярные градиенты. Различные характерные раковые клеточные особенности наблюдались как большие, взаимосвязанные структуры. Трехмерные сети TLS (третичная лимфоидная структура) показали внутри-TLS-паттерны. Взаимодействия PD1 (запрограммированный белок смерти клеток 1)-PDL1 (запрограммированный лиганд смерти-1) наблюдались в основном между Т-лимфоцитами и миелоидными клетками в когорте колоректального рака.

Анализ показал повторяющиеся переходы между морфологиями опухоли, некоторые из которых совпали с обширными градиентами эпигенетического регулятора и экспрессии онкогена. На инвазивных краях опухоли, в местах конкуренции между раковыми клетками, нормальными клетками и иммунологическими клетками количество Т-лимфоцитов было уменьшено, включая несколько типов клеток. По-видимому, было обнаружено, что локализованные архетипические двумерные характеристики CRC, такие как TLS, связаны с молекулярными градиентами и значительно больше в трехмерном анализе.

Микросреда опухоли (TME) показала пространственную организацию, охватывающую от трех до четырех порядков. Опухольные инвазивные поля показали инвазивные поля начинающего типа, муцинозные инвазивные края и глубокое расширение инвазивных краевного типа толкающего типа, расширяя опухоль в основную соединительную ткань и гладкие мышцы. Клеточные сегментации на 75 изображениях WSI показали, что CK+ (цитокератин-положительные) клетки нормального и опухолевого эпителия были отделены от кластера дифференцированных 31+ (CD31+) клеток эндотелия, в первую очередь сосудистой крови, десмин-положительных клеток стромы и CD45-положительных иммунологических клеток.

Иммунологические клетки, наблюдаемые в опухоли, включали CD8+ и запрограммированный белок смерти клеток 1-экспрессирует цитотоксические T-лимфоциты, CD4-экспрессирующие T-лимфоциты помощника типа, CD68-экспрессирующие и/или CD163-экспрессирующие макрофаги и CD20 Кроме того, наблюдались подкатегории, такие как CD4+ FOXP3+ Tregs (регуляторные Т-лимфоциты). Твердые аденокарциномы показали наибольший процент цитокератин-положительных раковых клеток (70,0%), в то время как соседние нормальные эпителиальные ткани имели наименьшие цитокератин-положительные клетки (25,0%) и имели изобилие иммунных клеток и стромальных клеток.

При колоректальном раке (CRC) от 1 до 17 наблюдаемых длин корреляции варьировались от 80,0 мм для кластера дифференцировки 31 позитива и 400,0 мм для CD20 или кератинового позитива. Длины были связаны с рецидивирующими гистоморфологическими характеристиками, включая малогабаритные капилляры среди кластера дифференцировки 31-положительных клеток, опухолевых листов для цитокератин-положительных типов клеток и третичные лимфоидные структуры для кластера дифференцированных 20-положительных клеток.

Виртуальные оценки TMA и реальные оценки TMA были сопоставимы, а результаты CyCIF соответствовали теоретическим данным. В соответствии с классифицированным моделированием данных анализа CyCIF kNN наблюдались градуированные переходы от низкосортной муцинозной/желудниковой к высококачественной бутонной/фрагментированной гистологии среди опухолевого/эпителиального и иммунологического/стромального тканевого компартмента. Маркеры CyCIF показали градуированную интенсивность внутри всей опухоли или совпадающие с локализованными градиентами морфологии.

Результаты показали, что эпителиально-мезенхимальные переходы и туберкулез в CRC1 характеризовались образованием крупных фибриллярных структур, появляющихся в виде небольших почек в поперечных сечениях на дистальных кончиках. Волокна могут вторгаться в различные среды, включая муцин и строму, которые, по-видимому, образуются в результате постепенного нарушения клеточной адгезии, связанной с градуированными эпителиально-мезенхимальными переходами. Команда наблюдала меньшую пролиферацию опухоли в почках и большую пролиферацию на глубоких инвазивных краях опухоли с различными уровнями активации фосфотирозинового пути и иммунологическим подавлением.

В целом, результаты исследования показали, что мультиплексированный анализ WSI характеризует градуированные и смешанные молекулярные и морфологические характеристики образцов CRC человека, подчеркивая крупногабаритные и отличительные структурные характеристики и внутри-TLS-различения пространственных моделей опухолей.