В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Nature Biomedical Engineering, исследователи описали разработку и применение трехмерного (3D) печатаемого устройства «лаборатория-на-чипе» (LOC), которое быстро обнаруживало наличие коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 ( SARS-CoV-2) в слюне пациента.

Французское исследование заболеваемости сердечно-сосудистыми заболеваниями во время пандемии COVID и кампании вакцинации
Ранее существовавший иммунитет против SARS-CoV-2 снижает распространение вируса, но повышает конкурентоспособность SARS-CoV-2 Omicron у хомяков
Обнаружено, что двойная мРНК вакцинация против COVID-19 увеличивает распознавание варианта SARS-CoV-2
Пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) высветила потребность в многофункциональных и экономичных методах диагностики, которые могли бы беспрепятственно диагностировать острые и выздоравливающие инфекции SARS-CoV-2, а также статус иммунизации пациентов после вакцинации. Несмотря на успехи в диагностике SARS-CoV-2, такая платформа LOC для использования в местах оказания медицинской помощи (POC) пока недоступна.

Диагностика на основе сгруппированных регулярных интервалов коротких палиндромных повторов (CRISPR) недавно привлекла внимание научного сообщества. Они используют эндонуклеазы, такие как CRISPR-ассоциированный белок 12a (Cas12a), и дают высокоспецифичные результаты в физиологических условиях. В сочетании с методами амплификации, такими как петлевая изотермическая амплификация (LAMP), эти анализы на основе CRISPR становятся действительно полезными. Затем они могут проводить обнаружение рибонуклеиновой кислоты (РНК) SARS-CoV-2 в клинических образцах, как правило, в аттомолярном диапазоне (10–18).

Ранее опубликованные платформы электрохимического обнаружения на основе POC CRISPR оказались недостаточно чувствительными для обнаружения клинически значимых количеств РНК SARS-CoV-2. Хотя биосенсоры EC на основе графеновых полевых транзисторов имели аналогичную чувствительность к РНК SARS-CoV-2, этим анализам не хватало возможностей мультиплексирования, и они были проверены с использованием образцов мазков из носоглотки на основе вирусной транспортной среды.

Об исследовании
В настоящем исследовании исследователи описали мультиплексное диагностическое устройство LOC, способное одновременно обнаруживать РНК SARS-CoV-2 и антитела против SARS-CoV-2 в необработанных образцах слюны. Они гарантировали, что образцы слюны подвергались воздействию раствора протеиназы К, а затем нагревались до 55°C в течение 15 минут. Еще один цикл нагревания при 95 °C в течение пяти минут в мощных резисторах позволил лизису РНК SARS-CoV-2 и инактивации нуклеазы. Образцы слюны прокачивали через мембрану из полиэфирсульфона (ПЭС) внутри реакционной камеры для обеспечения надлежащего связывания вирусной РНК. И наоборот, слюна для обнаружения антител прокачивалась непосредственно через сенсорный чип ЭК, который исследователи считывали с помощью потенциостата. Это устройство имело встроенный микрофлюидный чип, позволяющий автоматически обрабатывать жидкости для подготовки образцов слюны, обеспечивая при этом надлежащую амплификацию РНК для обнаружения РНК на основе CRISPR. Кроме того, он имел чувствительные показания для РНК SARS-CoV-2 и антител хозяина на том же чипе электрохимического (EC) биосенсора.

Исследователи разработали биотинилированный белок репликации A (RP) одноцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (оцДНК), который частично гибридизуется с зондами захвата пептидной нуклеиновой кислоты (PNA) и интегрировал молекулярный анализ на основе CRISPR в сенсорную платформу EC. Кроме того, они варьировали концентрацию и время инкубации RP, чтобы получить быстрое и высокое отношение сигнал/шум. Затем они инкубировали функционализированные биосенсоры ЭК с образцами слюны, содержащими смесь LAMP/Cas12a, которая побочно расщепляла биотинилированные RP одноцепочечной ДНК. Это приводило к снижению связывания полистрептавидин-пероксидазы хрена (HRP); таким образом, снижается осаждение тетраметилбензидина (ТМБ) локально на поверхности электрода. Другими словами, усиление LAMP увеличило чувствительность сигнала сверх предела обнаружения датчика (LOD).

Использование химии реакции на основе полистрептавидина-HRP/TMB для считывания позволило дополнительно усилить сигнал EC как для серологических, так и для РНК-сенсоров на основе CRISPR. Команда измерила пиковый ток или снижение осаждения TMB с помощью циклической вольтамперометрии (CV); изменение напряжения от -0,5 до 0,5 вольт. Наконец, исследователи проверили сенсорную платформу CRISPR-EC, используемую в исследовании, для определения её клинической ценности.

Результаты исследования
В исследовании описывается новое устройство, в котором использовалась химия реакции на основе полистрептавидина-HRP/TMB для считывания, чтобы усилить сигнал EC как для серологических, так и для РНК-сенсоров на основе CRISPR. Кроме того, в этом устройстве использовался индивидуальный молекулярный анализ, который за счет оптимизации РНК-зависимого расщепления Cas12a биотинилированной RP одноцепочечной ДНК выявлял нуклеиновую кислоту-мишень с большей чувствительностью, чем анализы CRISPR-Cas12a на основе флуоресценции, но в аналогичных временных рамках.

Из всех протестированных концентраций РФП один наномолярный (нМ) РФП и пять минут инкубации давали самый высокий сигнал без фонового шума. Сенсорная платформа CRISPR-EC дала LOD 0,8 копий на мкл, демонстрируя чувствительность почти в четыре раза по сравнению с анализами на основе флуоресценции, используемыми для проверки праймеров. Ток от электродов ЭК четко различал образцы слюны, отрицательные и положительные на SARS-CoV-2. Кроме того, анализ кривой рабочих характеристик приемника (ROC) продемонстрировал корреляцию между количественной полимеразной цепной реакцией с обратной транскриптазой (RT-qPCR) и анализом обнаружения на основе CRISPR-Cas12a. Кроме того, его датчик EC обнаруживал IgG со 100% точностью в клинических образцах, в отличие от твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Кроме того, исследователи отметили, что одновременное мультиплексное обнаружение различных вирусных антигенов, включая шиповидный (S)1-рецептор-связывающий домен (RBD), S1 и нуклеокапсид (N), привело к повышению диагностической чувствительности. Кроме того, в этом устройстве использовалась слюна — лучшая альтернатива мазкам из носоглотки для диагностики SARS-CoV-2. Слюну собрать легче, чем мазки из носоглотки. Кроме того, он предоставляет нуклеиновые кислоты и серологические данные во время и после заражения или вакцинации.

Компактная и герметичная конструкция этого диагностического устройства, уменьшенное число действий пользователя во избежание загрязнения или ошибок персонала делают его привлекательной системой тестирования POC даже для неподготовленных конечных пользователей. Самое главное, эта микрожидкостная платформа LOC четко различала четыре типа клинических образцов слюны SARS-CoV-2 в течение двух часов, что еще раз подчеркивает ее полезность в качестве системы тестирования POC.

Выводы
Подводя итог, можно сказать, что это удобное и недорогое устройство LOC, напечатанное на 3D-принтере, с оптимизированным рабочим процессом и возможностями мультиплексирования может расширить возможности как врачей, так и общественности, одновременно упрощая быстрый и простой мониторинг инфекции и иммунного статуса пациентов с COVID-19. . Это устройство может дать представление о стадиях заражения SARS-CoV-2, чтобы помочь сдержать распространение COVID-19; аналогичным образом, он может предоставить данные о титрах антител против SARS-CoV-2, чтобы помочь понять, как новые варианты SARS-CoV-2 могут повлиять на людей с иммунитетом, приобретённым в результате инфекции, вакцинации или их комбинации.

Источник